关键词：人牙乳头细胞 PTH DMP1 代写论文 中国论文 职称论文

[摘　要]代写论文目的:观察甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)对体外培养的人牙乳头细胞(human dentalpapilla cells,HDPC)牙本质基质蛋白1(dental matrix protein,DMP1) 合成分泌的影响。方法:原代方法培养出人牙乳头细胞,用不同浓度的甲状旁腺激素刺激培养的第5代人牙乳头细胞,免疫组化观察结果,并采用图像分析的方法, 进行半定量分析。结果:PTH可刺激人牙乳头细胞DMP1的表达,诱导的DMP1主要表达于细胞胞浆内,呈一定的浓度依赖性,0.3μg/mL为刺激最佳 浓度。结论:PTH能够刺激人牙乳头细胞产生DMP1,对牙乳头细胞向成牙本质细胞分化有一定促进作用,可能是成牙本质细胞分化的重要介质之一。

[关键词]人牙乳头细胞;PTH;DMP1　

牙本质基质蛋白1(DMP1)是牙齿发育过程中一种非常重要的非胶原基质蛋白,是富含丝氨酸的亲水性酸性蛋白。其主要表达于成牙本质细胞和长骨、颅 骨等部分骨组织,但现已认为其为矿化组织特异性蛋白[1]。在牙齿,DMP1的功能尚为确切,可能在牙本质矿化和在未分化间充质细胞向成牙本质细胞分化过 程中发挥着重要的作用[2]。甲状旁腺激素(http://www.51lunwen.net/parathyroid hormone,PTH)等亲钙因子参与胚胎发育,促进细胞生长分化和向成骨样细胞分化,对正常的矿化组织发育有重要的调节作用。本实验通过免疫组化方 法,观察PTH对体外培养的人牙乳头细胞牙本质非胶原蛋白重要组分DMP1表达的影响,探讨PTH在未分化间充质细胞向成牙本质细胞分化中的作用。

1　材料和方法

1.1　材料
甲状旁腺激素(PTH,Sigma,美国);鼠抗DMP1单克隆抗体(高杰博士惠赠);胎牛血清(FCS,Hy-clone, 美国);胰蛋白酶(Gibco,美国);TritonX-100(华美生物工程公司);DMEM、F12培养基(Gibco,美国);25 mL、100 mL培养瓶、24孔培养板(Gibco,美国);SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司); CO2孵箱(Forma Scientific,美国);YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂);倒置显微镜和照像系统(Olympus,日本)。

1.2　方法
1.2.1　人牙乳头细胞原代培养选择合法水囊引产的5月龄女胎,取其磨牙牙乳头组织,用组织块法[3]原代培养牙乳头细胞, 仔细剥离牙乳头组织,将其用剪刀剪碎,均匀铺于直径(d) 100 mm的培养皿中,置于CO2孵箱中,2 h后加入少量DMEM/F12培养液(含有150 mL/L的胎牛血清,青霉素100 U/mL,链霉素100μg/mL),12 h后再加入DMEM/F12培养液,隔日更换培养液。待细胞爬满培养皿后用2.5 g/L胰酶消化,按1∶2进行传代,制备爬片,免疫组化法鉴定细胞起源。
1.2.2　实验分组对照组:为含20 mL/L FCS的DMEM/F12(DMEM:F12体积比为1∶1)培养液。实验组:将PTH用对照组培养液稀释成0.03μg/mL、0. 1μg/mL、0. 3μg/mL、1μg/mL、3μg/mL 5个浓度。
1.2.3 　细胞培养取生长良好的第5代人牙乳头细胞,用2.5 g/L胰酶消化后,以2×104/L细胞浓度接种于铺有预处理无菌盖玻片(6 mm×6 mm)的24孔板中,在标准环境下孵育。倒置显微镜下观察细胞生长状况,待细胞爬满盖玻片70%~80%后,弃孔内液体和未贴壁细胞,用含20 mL/L FCS的DMEM/F12培养液代替原有培养液继续培养24h,吸去培养液,将24孔板随机分组,把稀释好的不同浓度实验组和对照组培养液加入到孔内,每 组4孔,各1 mL。换用实验组和对照组培养液分别培养,两组均隔日换液一次。标准化环境下培养1、3、5、7 d后取出盖玻片,0.01 mol/L PBS清洗3次,40 g/L多聚甲醛固定30 min,备用。
1.2.4 　免疫组化染色采用SABC方法。取固定好的细胞爬片,0.02 mol/L PBS缓冲液洗2次,每次5 min。30 mL/L过氧化氢液室温封闭30 min阻断内源性过氧化物酶,3 mL/LTritonX-100室温20 min,滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min,甩去多余液体,不洗。滴加1∶50稀释的小鼠抗大鼠DMP1抗体,4℃湿盒过夜。滴加生物素化羊抗小鼠IgG,37℃孵育20 min,滴加试剂SABC,37℃孵育20 min,DAB显色,镜下控制显色时间,上述各步骤后均用0.02 mol/L PBS缓冲液振洗3次,每次3 min。实验组空白对照用PBS代替一抗,其余步骤相同。梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
1.2.5　图像分析和统计学分析应用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像公司),将组织化学染色的细胞爬片在高倍镜下各取20个阳性染色部位,计算机测量其灰度值。运用t检验对各组均数进行检验。