摘要: 荧光原位杂交技术广泛用于分析复杂环境的微生物群落构成,可以在自然生境中监测和鉴定微生物,并能对未被培养的微生物进行检测。rRNA为靶序列寡核苷酸或PNA探针的荧光原位杂交能代写硕士毕业论文提供微生物的形态学、数量、空间分布等信息,现已成为环境科学研究领域中的热点技术。对荧光原位杂交技术的发展和在环境微生物学中的应用进行了综述,探讨了该技术的应用和发展前景。
关键词: 荧光原位杂交; 16S rRNA;寡核苷酸探针; PNA;环境微生物; 微生物生态学；代写硕士论文

在三废的综合治理中广泛应用到生物降解方法,因此只有充分了解环境微生物学和群落演替规律等生物学特性,才能提高环境科学研究中的生物学效能,推动 和深化环境整治工作合理利用环境资源。传统菌种分离培养的鉴定方法不仅耗时费力,而且不能精确地反映混合菌群的组成和多样性,对于一些培养条件要求较苛刻 或未被培养的细菌往往不能达到预期效果[1]。近几年,随着分子生物学技术如分子杂交、PCR、核酸测序等的发展,微生物学研究领域发生了深刻的变革,灵 敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能。借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段。荧光原位杂交技术 (Fluorescencein situhy-bridization,FISH)结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息,可以在自然或人工的微生境中监测和鉴定不同的微生物个 体,同时对微生物群落进行评价。FISH技术被广泛应用于揭示微生物的原位生理学特性和功能,现己成为微生物分子生态学研究的重要技术手段。

1．FISH技术的发展和技术原理
1969年,Pardue等[2]和John[3]两个研究小组发明了原位杂交技术(in situhybridization,ISH),这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下,检测出细胞内核酸序列。1988年,Giovannoni等 [4]首次将ISH技术引入细菌学的研究,使用放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物。1989年,DeLong[5]首次使用荧光标记寡核苷酸探针 检测单个微生物细胞。与放射性探针相比,荧光探针更安全,具有较好的分辨力,不需要额外的检测步骤。
此外,可用不同激发和散射波长的荧光染料标记 探针,在一步反应中同时检测几个靶序列。近几年,由于FISH技术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学 研究的有力工具[6]。FISH技术检测核酸序列是利用荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交,通过激发杂交探针的荧光来检测信号。该技术主要 包括以下几个步骤:①样品固定;②样品的预处理;③预杂交;④探针和样品变性;⑤杂交;⑥漂洗去除未结合的探针;⑦检测杂交信号。

2．　rRNA为靶序列的FISH检测
在微生物学研究中FISH检测最常使用的靶序列是16SrRNA,这是由于16S rRNA具有遗传稳定性,它的结构域具有保守区和可变区[7]。对于每个分类水平,根据rRNA目标区域可设计寡核苷酸探针,进行种属特异性鉴定。16S rRNA基因比较测序在进行微生物鉴定时是最简便和准确的,尤其是对混合菌群和未被培养的微生物进行诊断时更为重要。在每个处于复制和代谢活跃的细胞中高 拷贝的16S rRNA通常为监测单个细菌细胞提供了足够的靶序列。其他的靶序列如23S rRNA[8],18SrRNA[9-10]和mRNA[11]也被成功地用于FISH检测。近年来,广泛应用寡核苷酸探针或PNA探针的FISH技术对 特异微生物进行了鉴定和定量分析[12],表1中列举了一些微生物FISH杂交中应用的特异寡核苷酸探针。

3．FISH诊断环境微生物多样性
环境微生物的研究主要是依赖于纯培养,由于环境微生物中只有一部分能被培养,因此,进行微生物多样性分析 时其结果往往是局限的。研究不同的环境微生物时发现显微镜下可见的微生物99%以上通过常规方法不能被培养[16],可见对不同环境样品研究时微生物的总 数远远超过被培养的数量。微生物生态系统的比较rRNA测序分析比分类研究应用得更广泛原因是核酸序列可以提供遗传距离、分子杂交探针等信息,可进一步用 于鉴定、监测自然生态系统中的微生物[17]。FISH技术可以再现微环境中完整细胞的景象信息,具有更好的精确性因此在环境微生物多样性等研究领域被广 泛采用。近几年,应用FISH技术研究自然环境微生物群落的报道较多,如海水沉积物[18]的群落,海水[19]、河水[20]和高山湖雪水[21]的浮 游菌体、土壤[22]和根系表面[23]的寄居群落。FISH技术不仅能提供某一时刻的微生物景象信息,还能监测生境中的微生物群落和种群动态,如海水沉 积物连续流培养的微生物群落、原生动物摄食的增加对浮游生物组成的影响、季节变化对高山湖水微生物群落的影响等。此外,应用FISH技术检测和鉴定未被培 养的种属或新种属,如巨大硫酸盐细菌(Thiomargarita namibiensis)[24]、全噬菌属(Holophaga)和酸杆菌属(Acidobacterium)[25]等。FISH技术对于探明自然菌 群的生态学和组成,以及群落对自然和人为因素动态变化的应答研究均是最有力的技术手段。

4．FISH在水污染控制微生物生态学中的应用
早在1914年,Ardern和Lockett[26]就发明了活性污泥法净化废水,然而在 废水处理过程中微生物群落的作用和生态学特性一直没有得到深入地研究。研究活性污泥等复杂微生物群落时,分子生物学分析显示混合菌群具有较高的多样性,但 是只有非常少的微生物被分离和鉴定。可见,只有了解微生物个体、群落多样性以及絮体形成等特性,才能提高对处理系统的控制能力。http://www.51lunwen.net/master_degree.html 在废水处理中对活性污泥功能菌群进行检测和记数,并掌握其原位生理学信息是一项重要的内容。常规的方法是通过检测特异底物转化率来研究活性污泥中重要功能 菌群的活性,如氧消耗率、硝化、反硝化、磷吸收和释放、Fe3+的还原等。FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。放射 自显影和FISH(MAR-FISH)结合被用于研究水体微生物,检测细菌生活力、数目和对特异有机底物的消耗[27]。16S rRNA为靶序列的FISH检测技术是快速可靠的分子生物学工具,可以不依赖培养方法监测环境样品中的种群并对其进行系统分类。这种方法被用于检测活性污 泥微生物群落结构和数目,同时对特异菌群进行空间定位和原位生理学的研究。

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