蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统[1]。通过PTD携带的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40 nm 磁珠和200 nm 脂质体等[2]。目前已知的具有细胞穿膜效应的多肽序列如表1所示。
表1 　具有细胞穿膜效应的多肽序列
Table 1 　Amino acid sequences of intracellular transduction peptides
Peptide Amino acid sequence
HIV-1 TAT YGRKKRRQRRR
HSV VP22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRPRRPVE
Drosophila Antp RQIKIYFQNRRMKWKK
V region of Anti-DNA antibody VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA
Kaposi FGF AAVALL PAVLLALLAP
Grb2 (SH2 domain) AAVLL PVLLAAP
Integrinβ3 VTVLAL GALAGVGVG
HIV-1 gp41 (1223) GAL FL GFL GAAGSTMGA
Caiiman croc. Ig(v) light chain MGLGLHLLVLAAALQGAMGL GLHLLLAAALQGA
Influenza HA22 (1220) WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKAL KACEA
最常用的蛋白质转导结构域如：Antp43-58 (Antenapedia, 黑腹果蝇触足肽) 、TAT47-57 ( transactiviting protein, HIV-1 反式激活蛋白) 、VP22 (单纯疱疹病毒转录调节蛋白) 和Arginine-rich peptides (精氨酸富含肽) 等。本文主要介绍TAT-PTD。
1 HIV-1 TAT-PTD
TAT蛋白是HIV后期转录的调控子，是HIV-1的LTR 反式激活基因所表达的一种蛋白，可以正调控HIV-1基因组的转录和复制，在HIV 的生活史中起着极其重要的作用，对HIV的复制是必须的，TAT有86个氨基酸残基，由长为72个氨基酸与14个氨基酸的2个外显子组成。上个世纪80 年代末，Green和Frankel两个独立的小组同时发现TAT蛋白能够穿过培养的细胞膜进入到其他细胞中。
TAT 可以有效地介导外源物质进入细胞。1988 年，Maurice 和Paul发现TAT 蛋白能够穿过细胞膜。1994 年，Stephen将TAT 蛋白与其他外源蛋白用化学方法交联，成功地将外源蛋白质导入到了体外培养的细胞以及动物组织中，但以这种化学键连接后的融合蛋白在脑组织和肾脏中没有活性。1997 年，Eric Vives 等发现剪切后的TAT蛋白能够穿过细胞膜并在细胞核中聚集，并确定该蛋白转导的基本区段(basic domain) 为TAT 37～72 。到1998 年，Hikaru发现TAT蛋白的PTD 区段(protein transduction domain) 与其他蛋白融合表达的蛋白质(TAT-蛋白质) 能够高效地进入体外培养的细免费论文网 【http://www.51lunwen.net】胞，并且表现出生物学功能，具有生物学活性。1999 年，Schwarze S. R. [3]研究发现：TAT蛋白能够通过血脑屏障，积累到一定浓度并表现出蛋白的活性。2000 年，Lewin 等利用TAT蛋白将直径为45nm 的包裹有磁性微球的葡聚糖导入到细胞中。2001 年，Akiko Eguchi 等[4]利用TAT蛋白将外源基因导入到细胞，并且检测到较强的外源基因所表达的萤光素酶的活性。近些时候，严世荣、李敬风等将TAT蛋白的PTD 区段编码基因与外源蛋白基因连接表达融合蛋白，再将其转入小鼠体内，发现融合蛋白可以快速到达体内各组织，且表现出较强生物活性。
2 机制
关于蛋白质转导结构的透膜机制目前仍不十分清楚，但是已证明这种穿膜方式是不依赖于受体、通道、能量及胞吞作用。最近一些研究表明，用D-型氨基酸替代TAT(48 - 60)的L-型氨基酸，结果发现转导效率增强了；用TAT的颠倒结构同原始结构有同样作用；而且发现在变性条件下，蛋白质转导的能力增强；人工合成的分枝多肽(Rn) 4 中精氨酸的数目与其转导效率有关；带有胍基的拟肽也有同样作用，均可转导多种类型的细胞，均说明并非受体、配体作用模式。还有研究发现TAT(48 - 60)可以在细胞不能进行内吞的4 ℃条件下转导，用内吞作用的多种抑制剂，均不能抑制其转导作用，说明蛋白转导不是通过胞吞作用的 。另外，用叠氮钠和鱼藤酮阻止ATP产生，也不能抑制TAT(48 - 60) 衍生肽的转导作用，说明蛋白质转导并非能量依赖性。用药物阻断细胞通道，如brefelclin A(一种高尔基体蛋白转运抑制剂) ，仍不能抑制蛋白的转导。用PTD 碱性多肽处理细胞，并未发现细胞内乳酸脱氢酶外漏，可能不是通过膜通道进入细胞。实验证明，在4 ℃时尽管胞吞作用已失活，但是PTD和PTD 融合蛋白仍能快速有效地进入细胞。热力学实验证明，TAT-PTD 与细胞表面糖胺聚糖的解离系数约为1μmol/L，比同样带有负电荷的脂质膜大3个数量级。因此，TAT-PTD 与细胞表面糖胺聚糖的结合比脂质双层膜更为可能；PTD 与三个不同的糖氨聚糖(硫酸肝素、肝素和硫酸软骨素B) 有相似的热动学结合常数( K)，但结合点数目大致与硫酸化程度有关。研究表明，使用糖氨聚糖裂合酶选择性地降解硫酸肝素侧链，可竞争性抑制TAT 的转导。相反，如果加入的是主要作用于肝素而基本上不作用硫酸肝素的肝素酶，只有当该酶达到较高浓度时才能对TAT的转导起抑制作用。可以分解各种硫酸软骨素的软骨素酶A 、B 、C，以及特异性分解硫酸软骨素A和C 的软骨素酶A和C，对TAT-PTD 的转导能力没有影响。以上结果也提示，生物膜上的糖氨聚糖可能是PTD及相关蛋白的结合位点。细胞表面的硫酸肝素是跨膜的硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans , HSPG) 的膜外部分，这些HSPG可能是多种生物活性物质的共同受体。在无配体存在时，HSPG在细胞表面随机分布。当有特异性配体时，HSPG发生聚集并与细胞浆中的其他成分共同作用。在硫酸肝素上，可能存在有PTD阳性肽的几个独立的结合位点，PTD与硫酸肝素的紧密结合并形成中性PTD-糖氨聚糖复合物，为PTD的跨膜转导提供了固相化基础，并通过HSPG相互交联，激活细胞的摄取。这也解释了以PTD为载体介导的转运效率与细胞类型有关，因为有些细胞表面仅有少量的HSPG。最近的一些研究表明，在细胞内PTD及其复合物存在于内吞体内。提示细胞对PTD及其复合物的摄取可能通过细胞膜快速的静电作用，随后 本文来自：免费论文网 [http://www.51lunwen.net]