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(【关键词】 黄芪多糖; 增殖; 分化; mRNA; 前脂肪细胞
近年来许多研究表明，黄芪及其主要成分黄芪多糖（Astragalus polysaccharides, APS）可以调节糖脂代谢，具有改善胰岛素抵抗的作用，因此广泛运用于2型糖尿病、肥胖和代谢综合征等代谢相关性疾病的防治［1~4］。在以往的实验中，我们发现黄芪多糖可增加脂肪细胞葡萄糖的摄取和利用，促进前脂肪细胞的分化［3］，为了进一步探讨其影响前脂肪细胞增殖和分化的机制，本研究从影响脂肪细胞分化的两个主要基因过氧化物体增殖剂活化受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）和CAAT/增强子结合蛋白α（CAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα）mRNA与蛋白质水平，观察了APS对其的影响。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 3T3L1前脂肪细胞株， American Type Culture Collection（ATCC）产品；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco"s modified eagle"s medium, DMEM）、特级新生小牛血清、胎牛血清，Gibco公司产品；胰蛋白酶、青霉素G钠盐、硫酸链霉素、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）和溴化乙啶，Amresco公司产品；APS由复旦大学内分泌研究所提供；胰岛素、地塞米松、异丁基3甲基黄嘌呤、二甲氧唑黄｛2,3bis(2methoxy4nitro5sulfophenyl)5 ［(phenylamino)carbonyl］2Htetrazolium hydroxide, XTT｝、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、酶标二抗，Sigma公司产品；罗格列酮（rosiglitazone, ROS），浙江天马医药化工有限公司产品；Trizol试剂，Invitrogen公司产品；硝酸纤维素膜，Whatman公司产品；PPARγ和C/EBPα抗体，Adipogen公司产品；Access Realtime PCR System，Fermentas公司产品；BIO RAD Icycler 5色荧光定量PCR仪、紫外凝胶摄像分析仪和图像分析软件，Sygene Gene Genius公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 3T3L1前脂肪细胞的培养和诱导分化 将3T3L1前脂肪细胞用含10%小牛血清的高糖DMEM，在37 ℃、5% CO2的条件下培养，细胞状态良好时接种于培养板，待细胞生长至融合2 d后，加含0.5 mmol/L异丁基3甲基黄嘌呤、0.25 μmol/L地塞米松、10 μg/ml胰岛素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养48 h，换以含10 μg/ml胰岛素的培养液再培养48 h，随后以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养，每隔2 d换1次培养液，诱导分化8～12 d的3T3L1细胞85%以上呈脂肪细胞表型，可用于实验。
1.2.2 XTT法检测APS对3T3L1前脂肪细胞增殖的影响 将3T3L1前脂肪细胞按照不同的细胞浓度接种于96孔板，通过XTT法测定570 nm波长的吸光度值（OD570值），建立“OD570值细胞数目”曲线。然后再按1.5×104/ml 3T3L1前脂肪细胞的浓度接种96孔板，每孔100 μ免费论文网 【http://www.51lunwen.net】l培养基，细胞贴壁后分别加不同浓度的APS（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L）干预培养，通过XTT法分别检测各组的OD570值，通过“OD570值细胞数目”曲线计算出加药24、48和72 h时的细胞数目。
1.2.3 3T3L1前脂肪细胞分化的定量检测 将3T3L1前脂肪细胞按上述方法诱导分化。设置空白对照组（normal control, CON组）、黄芪多糖干预组（APS组）及罗格列酮干预组（ROS组），在培养液中分别加入不同的干预药物。APS为0.4 g/L，ROS为10 μmol/L，CON组加等体积生理盐水。在加分化液同时加药，药物与培养液同步更换。分化第8天进行油红O染色，拍摄照片。异丙醇处理已染色的细胞，裂解细胞后通过酶标仪对脂滴着色程度进行比色，570 nm波长检测OD值，定量分析细胞的分化程度。
1.2.4 APS对脂肪细胞PPARγ和C/EBPαmRNA表达的影响 在12孔培养板中，前脂肪细胞的分化培养和药物干预分组同前，在分化第8天时弃培养上清，收集细胞备用，实时聚合酶链式反应检测PPARγ和C/EBPα mRNA的表达。参照Trizol Reagent试剂盒抽提取各组细胞总RNA，取1 μl RNA样本加99 μl超纯水，在紫外分光光度计上比色进行RNA定量，用A260和A280的比值确定RNA的纯度，所有RNA样品A260/A280在1.7～1.9之间。PPARγ上游引物5’GACCACTCGCATTCCTTT3’，下游引物5’CCACAGACTCGGCACTCA3’，PCR产物266 bp；C/EBPα上游引物5"GGAAAGAAACGACTGGGAGC3"，下游引物5"CGACTAGACGCTATTGTGATT3’，PCR产物214 bp；GAPDH上游引物5’AAGGTCGGAGTCAACGGATT3’，下游引物5’CTGGAAGATGGTGATGGGATT3’，PCR产物222 bp。以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。RNA的反转录：以AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。各样本取1 μg的RNA，加OligodT 1.0 μl，再加DEPC水至体积为12 μl，置70 ℃ 5 min后，再加入5×RT buffer 4 μl、RNasin 1.0 μl、dNTP 2 μl后混匀，置37 ℃ 5 min后，再加入MMLV 1.0 μl，总体积为20 μl，置42 ℃ 60 min后，再置70 ℃ 10 min，冰上终止反应，cDNA即合成。PCR反应：5×RTPCR buffer 5.0 μl，250 mmol/L MgCl2 0.3 μl，10 mmol/L dNTP 0.75 μl，10 μmol/L引物1.0 μl，25×SYBR GreenⅠ 1.0 μl，103×Calibration 1.0 μl，5 U/μl HS ExTaq 酶0.25 μl，模板1.0 μl，DEPC H2O补足25 μl。扩增条件：95 ℃预变性3 min，之后95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，扩增75个循环。反应结束后，使用Sequence Detection System 软件分析PCR过程各检测样本的域值循环数（threshold cycle, CT）值，CT值随模板浓度增大而减小，故荧光实时定量PCR结果显示的CT值恰好和mRNA表达水平相反，通过2ΔCT计算，将统计数据转化成线性形式后进行
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