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(【关键词】 肿瘤; 白细胞介素8; 小鼠; 中医药
多种恶性血细胞和实体瘤细胞的生长有赖于自分泌白细胞介素8（interleukin8, IL8）的存在和参与，这也是在荷瘤情况下IL8增高的原因。肿瘤切除后，肿瘤抗原刺激及肿瘤自分泌不复存在，故血清IL8水平下降，表明手术切除肿瘤可以阻断或减少体内的免疫抑制因子，提升机体的免疫功能。因此，肿瘤组织中IL8的检测，能更好地了解机体免疫状况和肿瘤负荷情况，对病情估计和观察疗效具有重要的临床意义。本实验给予荷瘤鼠确定的病因学干预及针对性的治疗，即应用温中消痰方治疗“寒邪”干预的荷瘤鼠，采用双抗体夹心亲和素生物素系统酶联免疫吸附试验（avidinbiotin systemenzymelabeled immunosorbent assay, ABCELISA）法观察温中消痰方对肿瘤组织IL8含量的影响，应用实时聚合酶链式反应（realtime polymerase chain reaction, realtime PCR）法检测肿瘤组织IL8 mRNA的表达，探讨温中消痰方抗肿瘤的作用及作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂 昆明种小鼠50只，雌雄各半，6～8周龄，体质量（20±2.2）g，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK（沪）20030003。在中国科学院上海实验动物中心SPF级动物实验室内饲养，动物使用许可证号为SYXK（沪）20040011。传代S180腹水型荷瘤小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，本组瘤源为第4代。IL8小鼠ELISA试剂盒，上海博光生物科技有限公司产品；IL8引物及βactin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；PCR试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。
1.2 实验药物 温中消痰方（Wenzhong Xiaotan Recipe, WZXTR），由消痰散结方（Xiaotan Sanjie Recipe, XTSJR）加高良姜、干姜等组成，以水煮醇沉法制备，含生药2.5 g/ml；消痰散结方，由半夏、南星、全蝎和蜈蚣等组成，制法同前，含生药3.29 g/ml；中药均为上海市药材公司产品，经第二军医大学药学院生药学教研室鉴定，长征医院药剂科制备。喃氟啶片，50 mg/片，上海医药集团公司华联制药厂产品，批号060102。生理盐水、蒸馏水，均由长征医院药剂科提供。
1.3 动物分组和处理 昆明小鼠按体质量随机分为5组，即模型组，寒模组，喃氟啶组，温中消痰方组，消痰散结方组，10只/组。无菌抽取荷瘤小鼠腹水，用生理盐水稀释细胞数至2×107/ml，注射于小鼠右侧腋下，0.2 ml/只，建立移植瘤模型。除模型组外，各组动物种瘤前１周寒邪干预（各组灌饲0～4 ℃冰蒸馏水，10 ml/kg体质量，1次/d，连续3周），具体造模方法参照文献并加以改进［1, 2］。第2周将S180传代（4代）实体瘤匀浆后接种于小鼠右侧腋下，继续寒邪干预。接种48 h后各实验组灌胃给药，消痰散结方组和温中消痰方组给药0.4 ml/次，喃氟啶组按喃氟啶117.5 mg/(kg·d)的给药剂量，用蒸馏水配制成0.4 ml，3组给药均为1次/d，6次/周，连续2周；用药组开始给药后上午继续寒邪干预，下午给药；寒模组下午给予生理盐水；模型组不用药；各实验组给药剂量均按70 kg体质量人鼠体表面积换算。实验第22天，颈椎脱离术处死动物，解剖动物，肉眼观察移植瘤的局免费论文网 【http://www.51lunwen.net】部生长情况，取瘤测瘤质量、体积，取部分瘤组织分别－20 ℃、－80 ℃保存，作ABCELISA和PCR检测。
1.4 寒邪干预S180荷瘤鼠的鉴定 观察小鼠的一般情况，肿瘤的生长情况，每日冰蒸馏水灌胃后，以体温计插入小鼠肛门测肛温，每20 min测1次，5 min/次，共测7次。
1.5 采用双抗体夹心ABCELISA法检测肿瘤组织IL8的含量 所有OD值都应减除空白值后再行计算；以标准品1 000、500、250、125、62、31、16 OPG/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线；在492 nm处测吸光值。
1.6 引物设计 IL8基因引物序列：正义链，5CATAGCCATGTGGTTACTATCA3；反义链，5AGTAGCCATGATCTTGAGAAGT3（扩增片断长497 bp）。βactin引物序列：正义链，5CATCCTGCGTCTGGACCT3；反义链，5GTACTTGCGCTCAGGAGGAG3（扩增片段长499 bp）。
1.7 抽提RNA的完整性检测 反应条件：95 ℃，5 min，预变性；95 ℃，40 s，变性；55 ℃，40 s，退火；72 ℃，1 min，延伸，共计30个循环；72 ℃，10 min，延伸；4 ℃，保存。将PCR反应管同时置于同一多聚酶链反应仪中，按照上述反应条件设置，开始PCR反应。
1.8 电泳及半定量分析 配0.5×Tris硼酸电泳缓冲液（TrisBorate EDTA, TBE）300 ml；胶浓度1.7％（40 ml 0.5×TBE加0.68 g胶）；微波炉中火2 min溶解胶；冷却至60 ℃加入溴乙锭2 μl（0.5 μg/ml）；放入梳子，浇版，待凝固；加8 μl PCR反应产物和2 μl溴酚蓝；电泳50～80 V（5 V/cm）。制备2%琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物9 μl，加入含有溴酚蓝指示剂的10×电泳缓冲液1 μl，混匀后加样电泳，电压80 V。以标准DNA电泳分子量作为参照。在紫外光激发下，直接将电泳图像用Gis凝胶影像处理系统扫描进入计算机，并采用该系统软件分析电泳条带的面积和平均灰度，样品灰度值=面积×平均灰度，以βactin的灰度值作为内参校正IL8基因产物灰度值，进行半定量分析。
1.9 统计学方法 应用SPSS 10.0软件包，计量资料结果皆以x±s表示，采用方差分析，并作组间两两比较。计数资料采用χ2检验确切概率法分析。
2 结果
2.1 各组S180荷瘤鼠形态学及肛温的变化 各组S180小鼠接种肿瘤第1周，右上肢外侧皮下陆续出现肿块，并逐渐长大。寒邪干预的第1周，寒模组动物出现耸毛、蜷缩、四肢发冷和耳壳发白，肛温下降1.5 ℃左右，2 h后恢复正常；温中消痰方组动物畏寒的形态学表现出现较晚、历时短，肛温平均下降1 ℃左右，1 h后恢复正常。消痰散结方组、喃氟啶组动物形态学及肛温变化与寒模组基本一致；模型组动物肛温平均37.8 ℃，未见下降。各给药组动物的生存状况明显优于寒模组和模型组，结果发现寒模组、模型组肿块的生长速度快于中药组、喃氟啶组，造模第3周左右，寒模组和模型组小鼠明显消瘦，进食少，倦怠乏力，活动受限。
2.2 各组S180荷瘤鼠瘤质量、抑瘤率 第3周处死所有的实验动物，剥离肿瘤，肿瘤呈实质性，圆形或椭圆形，切面呈鱼肉状，瘤体较大者中央有小片坏死区。寒模组与模型组瘤质量、肿瘤体积分别与温中消痰
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